Флуоресцентний фільтр є важливим компонентом флуоресцентного мікроскопа. Типова система має три основні фільтри: фільтр збудження, фільтр випромінювання та дихроїчне дзеркало. Зазвичай вони упаковані в куб, щоб група разом вставлялася в мікроскоп.
Як працює флуоресцентний фільтр?
Фільтр збудження
Фільтри збудження пропускають світло певної довжини хвилі та блокують інші довжини хвилі. Їх можна використовувати для отримання різних кольорів, налаштувавши фільтр, щоб пропускати лише один колір. Фільтри збудження бувають двох основних типів — фільтри довгого проходу та смугові фільтри. Збудник зазвичай є смуговим фільтром, який пропускає лише довжини хвилі, поглинені флуорофором, таким чином мінімізуючи збудження інших джерел флуоресценції та блокуючи світло збудження в смузі випромінювання флуоресценції. Як показано синьою лінією на малюнку, ВР становить 460-495, що означає, що він може проходити лише через флуоресценцію 460-495 нм.
Він розміщується в межах траєкторії освітлення флуоресцентного мікроскопа та фільтрує всі довжини хвиль джерела світла, за винятком діапазону збудження флуорофора. Мінімальна пропускна здатність фільтра визначає яскравість і яскравість зображень. Мінімум 40% передачі для будь-якого фільтра збудження рекомендується, щоб передача в ідеалі була >85%. Смуга пропускання фільтра збудження має бути повністю в межах діапазону збудження флуорофора, щоб центральна довжина хвилі (CWL) фільтра була якомога ближчою до пікової довжини хвилі збудження флуорофора. Оптична щільність (OD) фільтра збудження визначає темність фонового зображення; OD — це міра того, наскільки добре фільтр блокує довжини хвиль за межами діапазону передачі або смуги пропускання. Рекомендується мінімальний OD 3,0, але ідеальним є OD 6,0 або більше.
Емісійний фільтр
Емісійні фільтри служать для того, щоб дозволити бажаній флуоресценції зразка досягти детектора. Вони блокують коротші хвилі та мають високу пропускну здатність для більших довжин хвиль. Тип фільтра також пов’язаний із числом, наприклад, BA510IF на малюнку (фільтр із завадами), це позначення стосується довжини хвилі при 50% максимальної пропускної здатності.
Ті ж рекомендації щодо фільтрів збудження справедливі для фільтрів випромінювання: мінімальна передача, пропускна здатність, OD та CWL. Емісійний фільтр із ідеальною комбінацією CWL, мінімального пропускання та OD забезпечує найяскравіші можливі зображення з максимально глибоким блокуванням і забезпечує виявлення найслабших сигналів випромінювання.
Дихроичне дзеркало
Дихроїчне дзеркало розміщується між фільтром збудження та фільтром випромінювання під кутом 45° і відображає сигнал збудження до флуорофора, одночасно передаючи сигнал випромінювання до детектора. Ідеальні дихроїчні фільтри та дільники променя мають різкі переходи між максимальним відображенням і максимальним пропусканням, із >95% відображенням для смуги пропускання фільтра збудження та пропусканням >90% для смуги пропускання фільтра випромінювання. Виберіть фільтр з урахуванням довжини хвилі перетину (λ) флуорофора, щоб мінімізувати розсіяне світло та максимізувати співвідношення сигнал/шум флуоресцентного зображення.
Дихроїчне дзеркало на цьому малюнку — DM505, назване так тому, що 505 нанометрів — це довжина хвилі при 50% максимального пропускання для цього дзеркала. Крива пропускання для цього дзеркала показує високе пропускання вище 505 нм, різке падіння пропускання ліворуч від 505 нм і максимальну відбивну здатність ліворуч від 505 нм, але все ще може мати деяке пропускання нижче 505 нм.
Яка різниця між довгопрохідним і смуговим фільтрами?
Флуоресцентні фільтри можна розділити на два типи: довгопрохідні (LP) і смугові (BP).
Довгочастотні фільтри пропускають довгі хвилі та блокують коротші. Довжина хвилі відсікання – це значення при 50% пікового пропускання, і всі довжини хвилі вище відсічки пропускаються фільтрами довгих частот. Вони часто використовуються в дихроїчних дзеркалах і емісійних фільтрах. Довгопрохідні фільтри слід використовувати, коли програма вимагає максимального збору випромінювання та коли спектральна дискримінація небажана або необхідна, що, як правило, стосується зондів, які генерують один вид випромінювання у зразках із відносно низьким рівнем фонової автофлуоресценції.
Смугові фільтри пропускають лише певний діапазон довжин хвиль і блокують інші. Вони зменшують перехресні перешкоди, дозволяючи передати лише найсильнішу частину спектра випромінювання флуорофора, зменшують шум автофлуоресценції і, таким чином, покращують співвідношення сигнал/шум у зразках автофлуоресценції з високим фоном, чого не можуть запропонувати довгопрохідні фільтри.
Скільки типів комплектів флуоресцентних фільтрів може поставити BestScope?
Деякі поширені типи фільтрів включають синій, зелений і ультрафіолетовий фільтри. Як показано в табл.
| Набір фільтрів | Фільтр збудження | Дихроичне дзеркало | Бар'єрний фільтр | Довжина хвилі світлодіодної лампи | застосування |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 нм | ·FITC: метод флуоресцентних антитіл · Ацидиновий апельсин: ДНК, РНК · Аурамін: туберкульозна паличка ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 нм | · Родамін, TRITC: метод флуоресцентних антитіл · Пропідію йодид: ДНК · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 нм | · Автофлуоресцентне спостереження ·DAPI: фарбування ДНК ·Hoechest 332528, 33342: використовується для фарбування хромосом |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 нм | · Катехоламіни ·5-гідрокситриптамін · Тетрациклін: Скелет, Зуби |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 нм | · Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Набори фільтрів, які використовуються для отримання даних флуоресценції, створені на основі основних довжин хвиль, що використовуються у флуоресцентних додатках, що базується на флуорофорах, які найчастіше використовуються. З цієї причини їх також називають на честь флуорофора, який вони призначені для візуалізації, наприклад DAPI (синій), FITC (зелений) або TRITC (червоний) фільтр-куби.
| Набір фільтрів | Фільтр збудження | Дихроичне дзеркало | Бар'єрний фільтр | Довжина хвилі світлодіодної лампи |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 нм |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 нм |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 нм |
| FL-Аурамін | BP470 | DM480 | BA485 | 450 нм |
| Техаський червоний | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 нм |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 нм |
Як вибрати флуоресцентний фільтр?
1. Принцип вибору флуоресцентного фільтра полягає в тому, щоб дозволити флуоресцентному/емісійному світлу проходити через кінець зображення якомога далі, і одночасно повністю блокувати світло збудження, щоб отримати найвище співвідношення сигнал/шум. Особливо для застосування мікроскопа з багатофотонним збудженням і повним внутрішнім відображенням слабкий шум також спричинить великі перешкоди для ефекту зображення, тому вимога до співвідношення сигнал/шум є вищою.
2. Знати спектр збудження та випромінювання флуорофора. Щоб побудувати набір флуоресцентних фільтрів, який генерує високоякісне, висококонтрастне зображення з чорним фоном, фільтри збудження та випромінювання повинні досягати високого пропускання з мінімальною пульсацією смуги пропускання в областях, які відповідають пікам збудження або випромінювання флуорофора.
3. Враховуйте довговічність флуоресцентних фільтрів. Ці фільтри мають бути непроникними для інтенсивних джерел світла, які генерують ультрафіолетове (УФ) світло, яке може призвести до «вигоряння», особливо фільтра збудника, оскільки він піддається впливу повної інтенсивності джерела освітлення.
Різні флуоресцентні зразки зображень
Ресурси зібрані та організовані в Інтернеті та використовуються лише для навчання та спілкування. Якщо є порушення, зв’яжіться з нами, щоб видалити.
Час публікації: 09 грудня 2022 р